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实验笔记丨CRISPR-dCas9实验步骤详解

质粒转化通常可通过两种方式实现，分别为电转和接合。通过电转进行质粒转化则需要制备目标菌株的感受态细胞，如何制备非模式菌株的感受态及电转条件摸索是实现高效率转化的关键步骤。接合的方式一般是通过携带打靶质粒的大肠杆菌（如S17）接合至目标菌株，然后进行阳性克隆筛选。

sgRNA长度：SpCas9一般为20nt。 sgRNA序列碱基组成：基因特异的sgRNA模板序列位于PAM序列前，PAM序列特征为NGG （N为任意核苷酸），选择3末端含有GG的sgRNA，可构成PAM序列。sgRNA序列应避免以4个以上的T结尾，GC含量最佳为30%-70%（40%-60%）。

这里我们先前已经完成： CRISPR-Cas9基因敲除sgRNA设计 输入目标基因组DNA序列 我们提供在线CRISPR设计工具（ http：//tools.genome-engineering.org ） 可以输入序列（例如，来自目的区域的一个1KB基因片段），识别和排列合适的靶位点，计算预测每个指定靶标的off-target位点。

测序鉴定：挑选阳性菌落送至测序公司进行测序鉴定。 扩大培养与提取：基于测序结果挑选目标菌落进行扩大培养，提取质粒以备后续实验使用。总结：CRISPRCas9系统的sgRNA设计与质粒构建过程需严格遵循科学原则和实验流程，以确保基因编辑的精准性与安全性，为生物医学研究与疾病治疗提供有力支持。

转染步骤包括：消化细胞、添加含polybrene的培养基，4小时后稀释polybrene，培养12-36小时后收集和处理，接着在基质胶中铺板并固化，再进行药物筛选。每个步骤都旨在确保转染的准确性和类器官的活性。总的来说，crispr-cas9技术和慢病毒转染为类器官研究提供了强大的工具，但操作过程中需细致谨慎。

基本的HDR机制包括几个步骤： （1）DSB每侧的DNA在5 - 3个方向上被切除（DNA被解开，5个部分被切除），导致每个断端上有3个悬垂。（2）然后通过一种叫做RPA的蛋白稳定单链外挂，并与Rad51重组酶蛋白（每个形成核蛋白丝）结合。

淘宝黑号怎么转白?

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2、京东黑号怎么恢复白号回收vx秒结白号？找客服，直接说明原因，最好能配一些图片，证明帐号确实有问题，当然这只适合一般代下比较少的用户，如果多了，基本不要找了，客户会直接告诉你，说最近下单异常，尽量少下一些不同地址的订单，基本上白不了了。

3、再者，刮卡活动也无法再中奖，这就是“刮卡黑”的现象。京东似乎对领豆活动设置了严格的风控，一旦触及了某些底线，账号就可能被纳入黑名单。例如，频繁参与京乐玩、京喜工厂等平台的活动，尤其是频繁刷分，确实会增加被黑的风险。京东的初衷是让更多人参与，而非让一部分人占据优势。